近日，華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術(shù)學院牛長纓教授團隊在BMC BIOLOGY上發(fā)表了最新成果“Gut symbiotic bacteria are involved in nitrogen recycling in the tephritid fruit fly Bactrocera dorsalis”。該文以世界性重大入侵害蟲——橘小實蠅Bactrocera dorsalis為對象，從生理生化、分子水平系統(tǒng)闡釋了腸道共生菌介導的橘小實蠅氮營養(yǎng)獲取策略，篩選出介導幼蟲氮營養(yǎng)獲取途徑的優(yōu)勢共生菌，揭示了共生菌介導的橘小實蠅氮循環(huán)的調(diào)控機制，為宿主昆蟲——共生菌營養(yǎng)互作模式提供了新的認知。
植食性昆蟲的取食、發(fā)育及繁殖取決于植物營養(yǎng)。對昆蟲而言，通常其寄主植物中碳氮比高，可利用氮營養(yǎng)匱乏，同時大量氮被昆蟲以含氮代謝廢物的形式排出體外，因此氮營養(yǎng)脅迫是限制植食性昆蟲生長發(fā)育的關(guān)鍵因素。
該研究對橘小實蠅成蟲、幼蟲、蛹及13株實蠅腸道潛在固氮菌進行固氮酶活測定，表明僅產(chǎn)酸克雷伯菌Klebsiella oxytoca具有固氮酶活性，其他樣品并未表達出固氮酶活力，暗示在自然條件下固氮菌不能穩(wěn)定地通過生物固氮為宿主提供氮營養(yǎng)。另一方面，發(fā)現(xiàn)隨著果實內(nèi)幼蟲的發(fā)育，蟲果中尿素含量逐漸積累；利用15N穩(wěn)定同位素示蹤法研究了橘小實蠅對尿素氮的同化、吸收能力，結(jié)果顯示使用15N標記的尿素飼喂成蟲、幼蟲后，其體內(nèi)不同組織中的δ15N及15N%值均顯著提高，抗生素處理后的橘小實蠅組織內(nèi)δ15N及15N%值顯著低于未經(jīng)抗生素處理組的相應δ15N及15N%值，表明腸道共生菌可將尿素氮轉(zhuǎn)化為實蠅可利用的氮營養(yǎng)，提高其組織內(nèi)氮含量。
利用宏基因組及宏轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，分析了生物固氮與尿素水解通路中關(guān)鍵基因在共生菌基因組中的表達情況，表明固氮酶編碼基因 （nifH、nifK） 轉(zhuǎn)錄缺失，導致固氮酶合成受阻，阻斷了電子傳遞過程，因此氮不能被腸道共生菌固定。另一方面，編碼脲酶復合體的URE、ureA、ureB、ureC、ureAB基因被成功轉(zhuǎn)錄，進而催化尿素水解產(chǎn)生氨。利用選擇培養(yǎng)基從橘小實蠅腸道挖掘了Morganella morganii、Citrobacter freundii、K. oxytoca、K. pneumonia四株潛在尿素水解菌，測定了其生長曲線、脲酶活力及脲酶基因表達量，結(jié)果顯示M. morganii在酸性條件下脲酶活性更強，另外三株細菌更適合在中性條件下表達脲酶活力，表明上述優(yōu)勢菌在橘小實蠅同化尿素氮的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
進一步構(gòu)建了共生菌介導的含氮代謝廢物降解及必需氨基酸合成通路匯總圖。其中，含氮代謝廢物如嘌呤、尿酸、尿囊素、尿囊酸、尿素等經(jīng)系列生物酶催化后水解為氨；氨被谷氨酸脫氫酶或氧化還原酶催化合成谷氨酸 （GLU） 或天冬氨酸 （ASP）；GLU及ASP在氨基轉(zhuǎn)移酶的催化下作為氨基供體參與必需氨基酸的合成。
在共生菌介導的必需氨基酸合成通路中，共涉及115個功能基因，匹配結(jié)果顯示介導精氨酸合成的argF基因在宏基因組注釋結(jié)果中缺失，其余功能基因均存在于橘小實蠅成蟲及幼蟲腸道共生菌基因組中，說明其腸道共生菌具備合成必需氨基酸（精氨酸除外）的能力。從共生菌在必需氨基酸合成過程中的參與程度上分析，Enterobacterales和Lactobacillales目細菌主要介導幼蟲必需氨基酸的合成；Enterobacterales、Orbales和Lactobacillales目細菌主要介導成蟲必需氨基酸的合成。
華中農(nóng)業(yè)大學在讀博士研究生任學明為論文第一作者，牛長纓教授為論文通訊作者，該研究是由國家自然科學基金國際（地區(qū)）合作與交流項目 （31661143045）和國家自然科學基金面上項目 （31972270） 資助。
【英文摘要】
Background
Nitrogen is considered the most limiting nutrient element for herbivorous insects. To alleviate nitrogen limitation, insects have evolved various symbiotically mediated strategies that enable them to colonize nitrogen-poor habitats or exploit nitrogen-poor diets. In frugivorous tephritid larvae developing in fruit pulp under nitrogen stress, it remains largely unknown how nitrogen is obtained and larval development is completed.
Results
In this study, we used metagenomics and metatranscriptomics sequencing technologies as well as in vitro verification tests to uncover the mechanism underlying the nitrogen exploitation in the larvae of Bactrocera dorsalis. Our results showed that nitrogenous waste recycling （NWR） could be successfully driven by symbiotic bacteria, including Enterobacterales, Lactobacillales, Orbales, Pseudomonadales, Flavobacteriales, and Bacteroidales. In this process, urea hydrolysis in the larval gut was mainly mediated by Morganella morganii and Klebsiella oxytoca. In addition, core bacteria mediated essential amino acid （arginine excluded） biosynthesis by ammonium assimilation and transamination.
Conclusions
Symbiotic bacteria contribute to nitrogen transformation in the larvae of B. dorsalis in fruit pulp. Our findings suggest that the pattern of NWR is more likely to be applied by B. dorsalis, and M. morganii, K. oxytoca, and other urease-positive strains play vital roles in hydrolysing nitrogenous waste and providing metabolizable nitrogen for B. dorsalis.
論文鏈接：https://bmcbiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12915-022-01399-9#Abs1
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