眾所周知，在釀酒過程中，“曲”對(duì)最終酒體的品質(zhì)有著舉足輕重的影響，所謂“曲為酒之骨”，大曲作為白酒的糖化發(fā)酵劑歷史悠久，至今仍具有無法替代的作用。其制作過程通常采用開放式的自然接種形式，原料和環(huán)境微生物的參與形成了復(fù)雜獨(dú)特的微生物群落，對(duì)白酒風(fēng)味的形成具有重要意義。
小麥源微生物菌群在制曲過程中對(duì)高溫大曲微生物群落的組裝和風(fēng)味物質(zhì)的形成至關(guān)重要。影響小麥源微生物群落結(jié)構(gòu)組成的因素有很多，如產(chǎn)區(qū)環(huán)境、病害感染、生物農(nóng)藥和微生物菌劑的使用等。近年來，研究人員采用多種方法對(duì)大曲微生物多樣性及微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律展開研究。但原料源功能微生物在制曲過程中的遷移演變規(guī)律及其對(duì)大曲品質(zhì)特征的影響尚不清楚。基于此，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的韓北忠教授團(tuán)隊(duì)在項(xiàng)目中擬基于菌系、物系和酶系多層面揭示原料源功能微生物在強(qiáng)化大曲中的應(yīng)用潛力，為建立原料選用標(biāo)準(zhǔn)和提高大曲品質(zhì)奠定理論基礎(chǔ)，也為實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工業(yè)化和標(biāo)準(zhǔn)化提供技術(shù)支持。
韓北忠教授團(tuán)隊(duì)對(duì)原料小麥和制曲過程中不同階段的大曲樣本進(jìn)行了微生物傳統(tǒng)培養(yǎng)法和高通量測序結(jié)合分析。同時(shí)進(jìn)行揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝物的分析，結(jié)合微生物分析結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析，挖掘重要微生物的代謝特征，表征微生物與風(fēng)味物質(zhì)之間的關(guān)系，討論微生物在制曲過程中的代謝功能，從更客觀的角度闡明小麥源微生物對(duì)大曲菌群和代謝物的貢獻(xiàn)。主要結(jié)果如圖1所示，小麥源細(xì)菌群落中相對(duì)豐度較高的主要有葡萄球菌屬、泛菌屬、伯克氏菌屬和糖多胞菌屬?，F(xiàn)有報(bào)道顯示，伯克氏菌屬中部分菌株可用做生物農(nóng)藥，抑制爛穗現(xiàn)象的發(fā)生。由此可見，小麥源微生物與小麥生長環(huán)境和狀況密切相關(guān)。由于高溫大曲制曲培菌過程高溫篩選，芽孢桿菌屬和嗜熱放線菌屬在制曲培菌后期占較高相對(duì)豐度。但整個(gè)制曲培菌過程中小麥源的細(xì)菌，如嗜熱放線菌屬和葡萄球菌屬與大部分非揮發(fā)性代謝物的相關(guān)性趨勢相反，而泛菌屬和糖多孢菌屬與揮發(fā)性代謝物的相關(guān)性相反。說明小麥源的細(xì)菌對(duì)高溫大曲中代謝物的積累有重要作用，這與后續(xù)參與到釀酒過程中的物系、菌系和酶系密切相關(guān)。
圖1 （A）小麥和過程曲中細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu) （B）Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)的細(xì)菌與非揮發(fā)性代謝物相關(guān)性熱圖（*表示P < 0.05；**表示P < 0.01）
通過在實(shí)驗(yàn)室水平下模擬車間高溫大曲的制曲培菌過程，以是否去除小麥源微生物為唯一變量，比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組培菌過程中可培養(yǎng)微生物數(shù)量、群落演替、代謝物積累和代謝通路表達(dá)的差異，全面直觀地闡述小麥源微生物在培菌過程中的功能作用，并篩選其中發(fā)揮最關(guān)鍵功能的小麥源核心菌屬，發(fā)掘核心微生物的代謝功能，旨在從控制微生物的角度優(yōu)選原料，調(diào)節(jié)和優(yōu)化高溫大曲培菌過程。
結(jié)果顯示在模擬制曲的中后期，芽孢桿菌屬成為了微生物群落結(jié)構(gòu)中的絕對(duì)優(yōu)勢菌，但兩組芽孢桿菌在種水平上差異較大（圖2），且整個(gè)模擬制曲培菌過程中糖、酸、醇、氨基酸類代謝物的含量具有顯著差異（圖3），有小麥源微生物參與的實(shí)驗(yàn)組芽孢桿菌種水平的多樣性高于滅菌組，糖、酸、醇、氨基酸類代謝物的含量也顯著高于滅菌組。這說明，小麥源芽孢桿菌在制曲培菌過程中起著十分重要的作用，與芽孢桿菌直接相關(guān)的糖類和氨基酸類代謝物是制曲過程中重要的美拉德反應(yīng)的底物，也是后續(xù)釀造過程中白酒風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的重要底物。
圖2 滅菌組和對(duì)照組細(xì)菌豐度前100的ASV系統(tǒng)發(fā)育樹和火山圖
圖3 通過VIP值篩選的滅菌組和對(duì)照組的主要差異代謝物含量
本研究通過多組學(xué)分析剖析了高溫大曲培菌過程中小麥源核心微生物和核心代謝功能，并通過有效的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明，小麥源微生物對(duì)大曲微生物群落演替和代謝物累積有重要的影響，小麥源芽孢桿菌在制曲培菌初期發(fā)揮了重要的作用。同時(shí)在研究過程中篩選出了一批發(fā)酵性能優(yōu)良的芽孢桿菌菌株，但由于生產(chǎn)過程中使用的原料小麥攜帶的微生物組成存在差異，因此功能菌株的應(yīng)用條件還有待完善。
關(guān)于制曲原料的研究除了原料源微生物，原料自身的組分對(duì)高溫大曲品質(zhì)的影響也十分重要。團(tuán)隊(duì)前期的研究表明原料中蛋白質(zhì)的含量和氨基酸組成、淀粉含量和直鏈支鏈淀粉比例對(duì)制曲過程中微生物組和代謝物組有重要影響，后續(xù)應(yīng)進(jìn)一步挖掘小麥源芽孢桿菌的代謝機(jī)制，為完善制曲原料小麥的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)，也為提升大曲品質(zhì)的穩(wěn)定性和制曲生產(chǎn)的智能化推進(jìn)奠定基礎(chǔ)。
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