近日，生命科學技術學院和農(nóng)業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用全國重點實驗室生物固氮團隊研究成果以“GmNAC039 and GmNAC018 activate the expression of cysteine protease genes to promote soybean nodule senescence”為題在線發(fā)表于植物細胞（Plant Cell），研究揭示了大豆GmNAC039和GmNAC018直接靶向于多個根瘤衰老關鍵基因GmCYPs促進根瘤衰老的分子機制，為大豆氮素高效吸收和高蛋白大豆培育提供關鍵基因資源。該文章同時被期刊編輯選為亮點工作進行評論（Doll, 2023）。
大豆與根瘤菌共生互作形成高效共生固氮體——根瘤，為大豆生長發(fā)育以及子粒蛋白含量提供約65%氮素來源。然而，根瘤共生固氮效率受其發(fā)育過程的嚴格調(diào)控，大豆根瘤固氮的終止即根瘤衰老，往往發(fā)生在大豆生殖發(fā)育階段的始莢期。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，大豆生長發(fā)育后期的田間施肥可以顯著提高產(chǎn)量和大豆子粒蛋白含量，其主要原因是大豆子粒發(fā)育對氮素需求量的劇增。因此，適當延遲根瘤衰老是減少田間施肥并保證大豆子粒蛋白含量的一個關鍵手段。根瘤衰老過程受宿主自身發(fā)育以及各種環(huán)境因素調(diào)控，根瘤衰老表現(xiàn)為根瘤豆血紅蛋白含量降低、根瘤顏色變化、固氮活性降低以及衰老標志基因如木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶（CYPs）的高度表達等，最終導致根瘤壞死和脫落。然而，根瘤衰老是如何被激活尚不清楚。
該研究以大豆根瘤為研究材料，首先對不同生長時期根瘤的表型以及固氮能力進行檢測，基于根瘤固氮酶活性、豆血紅蛋白基因表達水平等變化，選擇根瘤菌接種4周、8周和12周的大豆根瘤作為研究材料，對大豆衰老根瘤的轉錄組進行系統(tǒng)分析?；诖笠?guī)模毛根轉化實驗，對10個NAC轉錄因子進行功能研究，最終篩選到GmNAC039與其直系同源基因GmNAC018是介導大豆根瘤衰老的關鍵轉錄因子。
為了進一步確定GmNAC039和GmNAC018調(diào)控大豆根瘤衰老的作用，研究人員借助于CRISPR-Cas技術構建了GmNAC039和GmNAC018雙突變體，以及GmNAC039、GmNAC018和GmNAC030三突變體。研究發(fā)現(xiàn)，GmNAC039和GmNAC018的過表達顯著促進根瘤衰老，而GmNAC039和GmNAC018的敲除突變體則顯著延緩根瘤衰老，明確了GmNAC039和GmNAC018在介導大豆根瘤衰老中的關鍵作用。
為了進一步解析GmNAC039和GmNAC018調(diào)控大豆根瘤衰老的分子機制。建立了根瘤共生細胞的nCUT&Tag技術，結合轉錄組分析以及EMSA等方法，鑒定到了GmNAC039調(diào)控的靶基因。GmNAC039可以直接靶向多4個半胱氨酸蛋白酶基因GmCYPs的啟動子并激活它們的轉錄。研究發(fā)現(xiàn)，過表達4個GmCYPs基因都可以顯著促進根瘤衰老，而同時敲除4個GmCYPs基因則延緩大豆根瘤衰老，提高了根瘤的固氮活性。以上結果表明GmCYPs在介導根瘤衰老中發(fā)揮重要作用。
在本研究中，研究人員解析了大豆根瘤衰老的分子機制。鑒定到兩個NAC轉錄因子——GmNAC039及其同源基因GmNAC018，是大豆根瘤衰老的關鍵調(diào)節(jié)因子。GmNAC039通過直接調(diào)控4個GmCYP基因的表達來調(diào)控根瘤衰老。研究不僅建立了NAC-CYP分子模塊調(diào)控大豆根瘤衰老的模型，也為大豆氮素高效吸收提供關鍵理論依據(jù)。
華中農(nóng)業(yè)大學博士后余海翔和肖愛芳為文章的共同第一作者，博士生吳佳姍等參與了研究工作，曹揚榮教授為通訊作者，東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院陳慶山教授參與合作研究。該研究得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金以及生科院龍云計劃和百川計劃等項目支持。
【英文摘要】
Root nodules are major sources of nitrogen for soybean （Glycine max （L.） Merr.） growth, development, production, and seed quality. Symbiotic nitrogen fixation is time-limited, as the root nodule senesces during the reproductive stage of plant development, specifically during seed development. Nodule senescence is characterized by the induction of senescence-related genes, such as papain-like cysteine proteases （CYPs）， which ultimately leads to the degradation of both bacteroids and plant cells. However, how nodule senescence–related genes are activated in soybean is unknown. Here, we identified two paralogous NAC transcription factors, GmNAC039 and GmNAC018, as master regulators of nodule senescence. Overexpression of either gene induced soybean nodule senescence with increased cell death as detected using a TUNEL assay, whereas their knockout delayed senescence and increased nitrogenase activity. Transcriptome analysis and nCUT&Tag-qPCR assays revealed that GmNAC039 directly binds to the core motif CAC（A）A and activates the expression of four GmCYP genes （GmCYP35, GmCYP37, GmCYP39 and GmCYP45）。 Similar to GmNAC039 and GmNAC018, overexpression or knockout of GmCYP genes in nodules resulted in precocious or delayed senescence, respectively. These data provide essential insights into the regulatory mechanisms of nodule senescence, in which GmNAC039 and GmNAC018 directly activate the expression of GmCYP genes to promote nodule senescence.
論文鏈接：https://doi.org/10.1093/plcell/koad129
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