近10年柑橘芽變選種新進展

　　柑橘作為蕓香科植物，種類繁多，生產(chǎn)上涉及三屬八大類，是中國也是世界第一大水果，產(chǎn)業(yè)規(guī)模位居世界前列。然而隨著人們對柑橘品質的要求逐漸多元化，如何培育更多優(yōu)質的柑橘品種是目前育種工作者的難題。芽變選種是一種常用的育種方法，芽變是指在芽的分生組織細胞中遺傳物質自然發(fā)生的突變，是體細胞發(fā)生的變異，目前果樹芽變選種主要利用這一突變進行新品種選育，在細胞分裂復制并萌發(fā)抽生出枝條后，通過嫁接進行遺傳，這是一種高效且低成本的育種方式，但同時也存在隨機性。芽變通常改變品種的單個性狀，如果實顏色、果實形狀、果實無核、熟期等，因此通過芽變可以對本身具有優(yōu)良性狀的品種進行針對性改良。為了推動更多的柑橘芽變選種工作，本文對近10年柑橘芽變選種歷史進行回顧和展望。

 

　　近10年選育出的柑橘芽變新品種

 

　　發(fā)生芽變會導致植株多種性狀的改變，不同類型的芽變在不同物種中改變的性狀也不相同。芽變的表現(xiàn)復雜多樣，主要包括：葉的形態(tài)變異，如柑橘中的寬葉與窄葉之間發(fā)生的變異；果實的形態(tài)變異，如毛桃變異成油桃；枝條的形態(tài)變異，如柑橘枝條中有刺突變?yōu)闊o刺；植株的形態(tài)變異，如蘋果短枝芽變便是一種特別突出的變異。芽變現(xiàn)象在很多果樹中都會發(fā)生，發(fā)生頻率較高的果樹有蘋果、柑橘、桃、棗、葡萄、梨等，比率最高的為柑橘和蘋果，芽變頻率分別是75.4%和36.2%。近10年國內選育出的柑橘芽變新品種如表1所示。

 

　　柑橘屬中的臍橙通常由芽變選育而成，針對熟期方面，國內外從芽變選種中培育出了大批優(yōu)良的早熟及晚熟品種，改善了臍橙熟期過于集中的問題。華盛頓臍橙由普通甜橙芽變而來，紐荷爾臍橙又由華盛頓臍橙芽變選育而來，是世界著名良種之一，樹勢好、風味佳，但其果形不勻、差異較大，因此以紐荷爾臍橙為母本進行芽變選種，培育出整齊統(tǒng)一的果形是工作重點。

 

　　夏橙是柑橘屬的一個重要晚熟品種，但存在果實偏小、產(chǎn)量偏低的不足，廣西特色作物研究院通過芽變選種培育出果大少核的優(yōu)良品種桂夏橙1號。冰糖橙具有化渣、低酸、果肉脆嫩等優(yōu)點，周嘉發(fā)現(xiàn)，冰糖橙紅肉芽變株系具有較高的開發(fā)潛力。周小娟對晚棱臍橙及其芽變材料“南瓜狀臍橙”的相關生物學性狀進行分析發(fā)現(xiàn)，“南瓜狀臍橙”晚熟、皮薄汁多、維生素C含量高、風味濃郁，對這一芽變材料的挖掘和選育，具有良好的市場推廣前景與應用價值。同時，也從普通冰糖橙中選育出抗寒晚熟品種晚香蜜橙和抗逆性好、綜合性狀優(yōu)良的黔陽冰糖臍橙。

 

 

　　在溫州蜜柑方面，已從最原始的初代品系“在來系”和“伊木力”中先后選育出了早生和尾張等177個芽變品種，形成了豐富的溫州蜜柑品種群。例如，由尾張溫州蜜橘進一步芽變中選育出來的豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)新品種華夷1號，由溫州蜜柑龜井25的抗寒芽變選育出的優(yōu)質抗寒柑橘新品種龜井2501，由大分早生溫州蜜柑中發(fā)現(xiàn)的特早熟芽變新品種橘湘早。貢柑為中國寬皮柑橘主栽品種之一，但其種子較多、風味寡淡、不耐貯藏，科研人員通過芽變的方法選育出了很多無核或少核柑橘品種。

 

 

　　南豐蜜橘有風味佳、皮薄肉嫩、芳香宜人的優(yōu)點，但同時也存在不化渣的缺點，作為芽變選種材料，具有較大的發(fā)展?jié)摿?。如柳城蜜橘、阿?號和粵豐早橘便是從南豐蜜橘芽變中選育出的綜合性狀優(yōu)良、化渣性好的新品種。蜜廣橘是南豐蜜橘的自然雜交種，從蜜廣橘中芽變選育出桂橘一號優(yōu)良芽變株系。從春甜橘自然芽變單株中選育出來的柑橘品種明柳甜橘，果實品質優(yōu)良。砂糖橘品質佳，但多籽，采用芽變選種技術也選育出早熟品種金葵蜜橘以及粵農晚橘、華晚無籽砂糖橘和春紅糖橘等晚熟品種。

 

　　椪柑在我國廣泛種植，但缺少綜合性狀優(yōu)良的品種，因此通過芽變育種選育出豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、無核性狀穩(wěn)定、品質優(yōu)良的新品種是椪柑產(chǎn)業(yè)中的重要需求。華中農業(yè)大學培育出的華柑4號無核椪柑品種為我國椪柑產(chǎn)業(yè)提供了品種支撐。通過對金水柑母本樹及后代進行觀察而選育出少核椪柑新品種金水椪柑2號，其果實品質優(yōu)良、風味濃郁、耐貯藏。

 

　　琯溪蜜柚作為一種優(yōu)良蜜柚品種，也培育出六月早、紅綿蜜柚和黃金蜜柚、三紅蜜柚、迷你紅柚等芽變優(yōu)新品種。最原始的葡萄柚為白皮白肉的鄧肯，由它實生變異出無核馬敘，其果肉和果皮仍保持白色，可以通過芽變選種培育出更多優(yōu)良品種。

 

　　柑橘芽變新進展

 

　　當梢端分生組織中的細胞發(fā)生變異時，才有可能發(fā)生芽變?，F(xiàn)有對分生組織的研究主要有頂端細胞學說、組織原學說、組織發(fā)生層學說、分區(qū)學說和原套原體學說等。早在1940年Satina等就提出了組織發(fā)生層學說，其仍是目前解釋芽變的主流學說。

 

　　梢端位于莖的頂端，是指新梢的起始生長部位，梢端的分生組織中有3個獨立的細胞層，叫做組織發(fā)生層。這3個細胞層分別使用LⅠ、LⅡ、LⅢ進行表示，各起源層以不同的方式進行細胞分裂，之后形成不同的組織。表2是蘋果梢端分生層的衍生情況，LⅠ層位于最外側，通常只有一層細胞，進行垂周分裂之后分化為器官的表皮；LⅡ層位于中間層，通常也含有一層細胞，可進行平周分裂和垂周分裂，之后分化為外皮層和大部分內層細胞；LⅢ層位于最內側，與前兩層不同的是可含有多層細胞，且既有垂周分裂，也有平周和斜向分裂，通常會分化成器官的維管組織。一般而言由于植物種類和器官的不同，分化成的組織也存在差異。

 

　　當這3層組織發(fā)生層中的個別細胞發(fā)生突變，之后突變的細胞與未突變細胞同時進行細胞分裂，進而分化出擁有不同性狀的變異組織，則稱之為嵌合體。由于發(fā)生突變的細胞具有隨機性，在任何一層都有可能發(fā)生，因此嵌合體可分為周緣嵌合體和扇形嵌合體，細胞嵌合體主要類型如圖1所示。周緣嵌合體一般發(fā)生在大多數(shù)細胞還未開始分裂時，發(fā)生的時間較早；扇形嵌合體一般發(fā)生在細胞已經(jīng)開始大量分裂時期，發(fā)生的時間較晚。隨著時間的推移，變異在經(jīng)過人工或自然的選擇之后得以純化和穩(wěn)定，表現(xiàn)出明顯的變異性狀，幾乎所有最初是嵌合體的不定尖芽，都會變成非嵌合體或周緣嵌合體，并被人們發(fā)現(xiàn)和利用。

 

　　在柑橘果實中，LⅠ層產(chǎn)生果實的汁胞和外果皮，LⅡ層產(chǎn)生種子、囊衣、皮下組織和中果皮，LⅢ層產(chǎn)生維管束，比如Zhang等研究了由常山胡柚（O）嫁接到尾張溫州蜜柑（C）上形成的OCC（LⅠ-LⅡ-LⅢ＝O-C-C）嵌合體，分析了OCC和兩個親本之間果實中原代代謝物、揮發(fā)性物質和類胡蘿卜素等各成分的含量，確定嵌合體的果皮來自尾張，而汁胞來自常山胡柚。在這些組織發(fā)生層上發(fā)生變異時，可以通過生殖細胞遺傳給后代，所以育種者往往會應用這些材料來分離、純化變異，使有利的性狀由嵌合狀態(tài)成為同質體，從而進行穩(wěn)定遺傳。

 

　　柑橘主要進行無性繁殖，在遺傳上高度雜合，因此人們對其芽變分子機理的研究相對局限。目前，多集中于反轉錄轉座子插入、表觀遺傳（以DNA甲基化的研究為主）、基因結構變異、染色體變異等方面。

 

　　轉座子又稱轉座元件，可以通過轉移或復制從基因組中某一位點進入到另一位點，從而導致遺傳物質發(fā)生改變。按照轉座方式，轉座子可以分為兩大類，一類在轉座酶作用下直接以DNA進行轉座，稱為DNA轉座子；另一類則通過反轉錄酶將RNA反轉錄成DNA之后進行轉座，稱為反轉錄轉座子，在高等植物基因組中以高拷貝的形式普遍存在。正是由于不同品種在形成轉座子時條件和機制的不同，以及同一轉座子在不同品種中的拷貝數(shù)差異，人們開發(fā)了一些基于轉座子來鑒別芽變的技術。比如，柯玲俊等便利用轉座子顯示技術（TD），篩選了5個DNA轉座子和4個反轉錄轉座子，有效地鑒別了不同成熟期、有核無核、色澤突變等多種性狀的柑橘芽變品種；吳志娟等則基于反轉錄轉座子插入多態(tài)性（RBIP）分子標記，篩選出17個位點，構成了45份越橘品種和1份蔓越橘品種的唯一分子身份證，為越橘品種的鑒別提供了有力工具。

 

　　表觀遺傳是指在生物體內的DNA序列未發(fā)生變化的情況下，其表型卻發(fā)生了可遺傳的變化，其中最早被發(fā)現(xiàn)、研究最深入的表觀遺傳調控機制之一便是DNA甲基化。DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶的催化作用下，在基因組DNA鏈上的胞嘧啶（C）第5號碳原子上共價結合一個由S-腺苷甲硫氨酸作為供體的甲基基團，最終形成5-甲基胞嘧啶（5-mC），該修飾方式能夠改變基因的表達，但通過一般的分子標記無法進行檢測。在植物中，甲基化通常發(fā)生在對稱的CG、CHG序列以及不對稱的CHH序列中。徐記迪通過研究暗柳橙和紅暗柳橙果實不同發(fā)育時期的DNA甲基化水平發(fā)現(xiàn)，甜橙的DNA甲基化水平介于擬南芥和番茄之間，且在果實不同發(fā)育時期的DNA甲基化水平是動態(tài)變化的。賈慧慧在研究DNA甲基化對柑橘生殖發(fā)育作用時發(fā)現(xiàn)，不論是無融合生殖細胞還是孢子體細胞，在植物受精后會發(fā)生明顯的加甲基化現(xiàn)象。

 

　　染色體變異主要包括染色體結構和數(shù)目的變異。染色體結構的變異往往造成DNA堿基序列發(fā)生變化，是內因和外因共同作用的結果，變異類型包括易位、倒位、缺失、重復等；染色體數(shù)目的變異既包括染色體組成倍的增加或減少，同時還包括個別染色體的增加或減少，其中最為常見的便是多倍性變異，一般表現(xiàn)為葉片、氣孔、果實等的增大?；蚪Y構變異也是導致芽變的重要原因之一。如由甌柑突變成的滯綠果實青甌柑中葉綠素降解關鍵基因PaO、PPH等和葉綠素循環(huán)的關鍵基因NYC1在轉色期顯著下調表達，而CAO及調控葉綠體發(fā)育的轉錄因子ELIP和GLK1在轉色期及貯藏期顯著上調表達，這可能與青甌柑芽變形成有關。

 

　　影響芽變的因素

 

　　根據(jù)植物遺傳物質等的不同，植物發(fā)生芽變的部位和頻率都會有所差異，例如，芽變通常發(fā)生在植物的分生組織中而不是成熟的組織中，這是因為轉座子在植物不同的發(fā)育階段其活性有差異。有的植物會因為轉座子的存在而有較高的體細胞突變率，而有的植物則因為存在DNA的修復而發(fā)生突變的頻率較低。除了這些植物自身的差異導致突變概率的不同之外，外界的一些因素也能加快誘導植物體內遺傳物質發(fā)生改變。

 

　　植物在遭受外界環(huán)境脅迫時，往往可以增加突變發(fā)生的概率，其中大致可分為物理因素和化學因素，物理因素包括溫度、水分等逆境脅迫，化學因素包括電離輻射、重金屬、紫外線等。前人研究發(fā)現(xiàn)，溫度的升高會促進擬南芥的突變，鹽脅迫和紫外線誘導導致擬南芥體細胞突變水平下降，鎘作為一種抑制DNA修復的誘變劑，可大大增加擬南芥的突變水平。

 

　　檢測柑橘芽變的方法多種多樣，有些可以通過形態(tài)學觀察來鑒定。但是有的芽變品種則是改變了果實的風味等不好辨別的性狀，一般需要細胞學觀察和分子標記技術等來確定其遺傳物質發(fā)生的改變。

 

　　細胞學標記主要包括染色體核型和帶型。最常用的標記技術便是流式細胞術。流式細胞術是指利用流式細胞儀對處在快速直線流動狀態(tài)中的細胞或生物顆粒同時進行多參數(shù)、快速定量分析和分選的高新技術，通過測量每個細胞中DNA的含量以及DNA含量的變化來檢查染色體，從而識別非整倍體和多倍體。然而此技術無法檢測到染色體結構和基因結構上發(fā)生的變異，且染色體數(shù)目變化較難維持遺傳穩(wěn)定性，因此使用有限。如今被廣泛應用的鑒定手段為分子標記技術，分子標記多是以DNA序列之間的差異為研究對象，通過構建DNA指紋圖譜，分析DNA片段來區(qū)分個體間的遺傳變異，該鑒定技術可靠且有效，可有效排除環(huán)境引發(fā)的飾變。所有分子標記可根據(jù)檢測方法和通量不同分為三大類：第1代是基于分子雜交技術的低通量分子標記，如RFLP；第2代是基于PCR技術的中等通量標記，如RAPD、AFLP、SSR等；第3代是高通量序列標記，如SNP。各分子標記之間的比較及在柑橘中的應用如表3所示。

 

　　經(jīng)過近20年的高速發(fā)展，我國柑橘產(chǎn)業(yè)在生產(chǎn)規(guī)模、品種結構以及產(chǎn)品質量方面都發(fā)生了巨大的變化。

 

　　芽變選種加快了柑橘產(chǎn)業(yè)的大規(guī)模、高質量發(fā)展。果樹新品種產(chǎn)生的重要來源之一就是芽變。就我國柑橘產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)規(guī)模來說，栽培面積從1961年的7.14萬hm2增長到了2021年的293.53萬hm2，約增長了40倍，總產(chǎn)量從1961年的18萬t增長到了2021年的5595萬t，約增長了310倍。我國柑橘栽種面積和產(chǎn)量的快速增長離不開芽變選種。芽變選種得到的新品種與其母樹相比，適應性更強，品質也更加優(yōu)良，在生產(chǎn)中很容易進行大面積的推廣應用。另外，芽變選種的操作相對簡單，只需要“一把尺，一桿秤，用牙咬，用眼瞪”，便于大規(guī)模、群眾性的選育工作展開，且一經(jīng)選出，能即刻進行無性繁殖，快速投入生產(chǎn)，具有成本低、見效快等優(yōu)點，大大加快了我國柑橘產(chǎn)業(yè)的大規(guī)模發(fā)展。

 

　　芽變選種豐富了柑橘品種結構類型，滿足了我國市場需求，引領我國柑橘產(chǎn)業(yè)高質量發(fā)展。柑橘產(chǎn)生芽變的頻率在果樹中相對較高，據(jù)調查，在桃、杏、蘋果、梨、柑橘、葡萄6個果樹種類總共3674個品種中，芽變的品種占600個，占據(jù)了總品種數(shù)的16.3%，其中蘋果和柑橘發(fā)生芽變的概率最高，柑橘芽變的品種占柑橘總品種數(shù)的75.4%。臍橙最早是1820年從巴西甜橙中選育出來的無核品種，美國加州于1873年引入臍橙成功后，將其命名為華盛頓臍橙，我國后續(xù)引進的一系列臍橙基本直接或間接來自華盛頓臍橙。風味濃、品質優(yōu)的溫州蜜柑也是從某種有核寬皮柑橘的芽變中選育出來的，且隨著芽變選種工作的大范圍展開，溫州蜜柑品種群不斷壯大。人們的生活水平不斷提升后，已經(jīng)不局限于風味或外觀品質的提高，開始針對柑橘熟期過于集中的問題，廣泛展開了柑橘成熟期芽變選種的工作，先后選育出具有早熟特性的贛南早、大分早生和青秋臍橙等，具有晚熟特性的不知火、清見和晚白柚等，顯著延長了柑橘的市場供應周期，使柑橘的鮮食品質與市場競爭力都極大地提高，是保障我國鮮食柑橘消費市場周年供應最經(jīng)濟有效的技術途徑。

 

　　芽變選種得到的優(yōu)系中的某些特殊物質能夠助力產(chǎn)業(yè)振興，促進健康中國的發(fā)展。芽變選種選出的溫州蜜柑中含有豐富的β-隱黃素，能夠有效抵抗癌細胞產(chǎn)生。葡萄柚較其母樹含有更加豐富的維生素C和維生素P，能夠有效緩解咽喉炎癥，減少呼吸道疾病，更是少有的富含鉀而鈉含量很少的水果，能有效輔助治療高血壓、心臟病和腎臟病。在琯溪蜜柚本身不含番茄紅素的情況下，其芽變選育出的紅肉蜜柚卻含有極其豐富的番茄紅素，而番茄紅素是目前在自然界植物中發(fā)現(xiàn)的最強的抗氧化劑之一，能有效增強人體的免疫力。

 

 

　　芽變選種的未來應當以市場和生產(chǎn)為導向，選育出既能滿足消費者口味和需求，又能解決生產(chǎn)中遇到的難題的新品種。例如為解決柑橘集中上市的問題，選育出特早熟或特晚熟的新品種，實現(xiàn)柑橘的全年供應，同時避免集中上市、果賤傷農。選育出一批抗寒、抗病、具有加工品質的品種。長江中下游地區(qū)的柑橘產(chǎn)業(yè)的擴大始終被寒害這個因素所困擾，因此選育出具有抗寒效應的品種與砧木具有重要的現(xiàn)實意義。對于全國柑橘產(chǎn)業(yè)來說，柑橘黃龍病、柑橘裂皮病、柑橘青枯病、柑橘潰瘍病等病害長期以來始終對柑橘產(chǎn)業(yè)造成危害，加強對抗病或者對這些病害有免疫力的品種或砧木的選育同樣也具有現(xiàn)實意義。

 

　　由于柑橘育種周期長，加強對柑橘芽變機理的研究有利于人工創(chuàng)造芽變，縮短育種時間，甚至定向誘變所需要的性狀。目前大多數(shù)的柑橘芽變屬于自然變異，隨機性大，頻率較低，且不可操縱、不可預知。針對性的輻射誘變、化學誘變等人工誘導方式可提高芽變頻率，同時芽變和親本本身就是一份很好的對照材料，通過兩者相對比可以發(fā)掘控制該變異性狀的基因相關功能，為后期進一步研究提供材料。

 

　　開發(fā)能夠高效誘導芽變的現(xiàn)代人工誘導技術是未來芽變育種發(fā)展的基礎，高效芽變鑒定和篩選手段是關鍵。近年來現(xiàn)代高通量儀器的發(fā)展與分子標記技術的結合產(chǎn)生了可用于誘變群體的基因型和表型的連續(xù)多代高通量鑒定，同時高通量靶向測序與DNA標記技術的結合，也大大地提高了DNA變異鑒定的效率。

 

　　盡管如今分子育種技術層出不窮，但芽變選種由于操作簡單、投入生產(chǎn)較快等特點，在未來的柑橘育種中仍然發(fā)揮著重要的作用。我們要加快對柑橘育種機理的研究，抓住我國獨特的種質資源，將理論與實踐相結合，培育出更多優(yōu)質新品種，促進我國柑橘產(chǎn)業(yè)向前發(fā)展。