2021年9月28日，Nature Communications在線發(fā)表了華中農業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室水稻團隊、湖北洪山實驗室李一博教授課題組題為“The identification of grain size genes by RapMap reveals directional selection during rice domestication”的研究論文。該研究開發(fā)了一種快速、高通量克隆數量性狀位點（QTL）基因的新方法——RapMap（圖1），發(fā)現了單位點遺傳的本質判斷標準，快速克隆了8個水稻種子大小QTL基因，并揭示了秈稻細長粒形是在水稻長期馴化和改良進程中定向選擇的結果。
圖1 RapMap定位克隆QTL基因的原理和流程
作物的產量、品質以及抗生物和非生物脅迫相關性狀大多是由QTL控制的，對這些QTL進行遺傳解析和分子克隆是理解遺傳多樣性與遺傳改良作物的基礎。獲取單位點分離的遺傳定位群體，是克隆QTL基因的先決條件。傳統(tǒng)QTL克隆方法通過構建復雜遺傳群體（RIL、MAGIC和NAM等）進行QTL定位、利用高級作圖群體（NIL、SSSL和IL）實現單位點遺傳，但是該過程耗時耗力，大大限制了QTL基因克隆的效率和應用進程。
為提高獲取單位點遺傳群體的效率，該研究首先根據顯性、半顯性和超顯性三種遺傳效應總結出了12種單位點遺傳分離模型，并在此基礎上提出單位點遺傳分離的本質特征是在任意遺傳分離群體中目標QTL/基因區(qū)段的兩種純合基因型能夠與對應表型共分離，即共分離標準（圖1c）；該“共分離標準”是單位點遺傳的充要條件，對遺傳學中單位點遺傳分離的傳統(tǒng)判斷標準（如雙峰分布、3:1分離比等）起更正和澄清的作用，這一判斷標準的更新，大大提高了獲取單位點分離群體的效率和可能性。為了最大可能地滿足分離群體的共分離標準，該研究提出并實踐了從核心種質選取表型差異較小的雙親構建一系列F2梯度群體（F2GP）進行遺傳定位的策略（圖1a），以期最少化每個遺傳群體中控制目標性狀的分離位點數量，并克隆不同雙親組合中的主效QTL；不滿足共分離標準的群體，可通過自交低、中、高值的F2或F3的若干家系，根據后代分離情況，選取目標區(qū)段雜合而背景分離位點純合的家系來實現單位點分離。F2梯度群體結合單位點遺傳的共分離標準，實現了QTL定位、驗證及其類近等基因系（NIL-LL）篩選的“三位一體”的基因定位與克隆策略，大大節(jié)省了獲取單位點遺傳定位群體的時間和成本。該研究通過構建15個種子大小F2梯度群體，在三年內克隆了8個種子大小基因（圖2），其中除了GS3、GW5、GS2、GW8和GW7/GL7等已報道基因外，還有兩個新基因GL1和GW5.1及兩個GS3強功能新等位基因GS3-5和GS3-6也得到克隆，這表明RapMap在QTL克隆方面具有較大潛力。
圖2 粒長和粒寬F2梯度群體的親本組合
與傳統(tǒng)作圖群體和定位方法相比，RapMap的優(yōu)勢主要在如下方面：一是RapMap兼具雙親本遺傳群體的精度和多親本遺傳群體的遺傳多樣性；二是F2梯度群體實現了雙親選擇和群體構建的簡單性、靈活性和全面性的統(tǒng)一，構建時間短、成本低；三是RapMap通過共分離標準將QTL定位、QTL效應驗證和類近等基因系篩選三個QTL克隆關鍵環(huán)節(jié)實現“三位一體”，大大提高了QTL克隆的準確度和效率，是以基因克隆為目標導向的方法；四是RapMap不僅可以克隆自然變異中的主效基因，還能鑒定克隆出自然群體中的稀有變異和微效基因；五是RapMap不依賴于復雜的軟件和統(tǒng)計方法，而是基于基因型和表型的直接對應，避免了假陽性和假陰性的干擾，提高了QTL定位克隆的可靠性；六是通過F2梯度群體結合共分離標準，RapMap可有效地將復雜的多基因遺傳降低到簡單的單位點遺傳，從而實現一個群體只克隆一個主效QTL基因、多個群體批量克隆多個QTL基因的突破。以上特點表明，以梯度遺傳群體的構建和單位點遺傳的“共分離標準”為核心的RapMap方法，是一個集QTL定位、驗證及其類近等基因系篩選“三位一體”的快速、高通量基因克隆策略；該方法同樣也適用于其他任何易于雜交和繁衍足夠雜交后代的植物和動物的任意性狀，或將成為QTL基因定位克隆的通用與首選方法，將助力功能基因組學與遺傳學研究。
RapMap克隆得到的8個種子大小基因可以解釋77.2%的粒形變異，對粒長、粒寬和長寬比表型預測的準確度可達0.82、0.79和0.87，表明這些基因對粒形表型具有高的貢獻率和代表性，為群體水平分析粒形馴化提供了很好的前提。通過研究這8個基因在野生稻、農家種和栽培品種的等位基因頻率變化，發(fā)現長粒和細粒等位基因在馴化過程中是逐步累積的，粒長和粒寬平均值也相應地變長和變窄（圖3a-c），表明水稻粒形在馴化和改良進程中發(fā)生了定向選擇，且這種定向選擇的強度在秈稻中比粳稻中更強。同時，該定向選擇伴隨著核苷酸多樣性降低的趨勢，表明在水稻馴化改良過程中，細長粒等位基因被偏好性地選擇和富集了。選擇清除分析表明主效基因GS3、GW5及GW7/GL7受到強烈馴化選擇，暗示了基因效應和選擇壓力的相關性（圖3d）。相關性分析進一步表明，DNA變異、選擇壓力、表型變異解釋率及表型關聯(lián)顯著性之間存在顯著正相關（圖3e），這說明對種子大小基因的選擇壓力讓人類有更多機會在自然群體中鑒定到大效應的基因，比如通過全基因組關聯(lián)分析（GWAS）等方法；而GWAS對微效基因或稀有變異檢測能力的不足，可通過RapMap方法來進行補充。
圖3 八個粒形基因的定向選擇以及DNA變異、選擇壓力、表型變異解釋率及表型間的顯著性相關分析
綜上表明，RapMap為復雜性狀QTL基因定位克隆和遺傳基礎解析提供了有效手段，提出了單位點遺傳的本質判斷標準，該研究發(fā)現的新基因和新等位基因為種子大小遺傳改良提供了新基因資源；種子大小基因的選擇清除分析及秈稻粒形在馴化改良過程中的定向選擇等結果為水稻粒形研究提供了新見解。
我校生命科學技術學院博士后張俊成、博士研究生張德建、博士研究生樊亞偉為文章的并列第一作者，李一博課題組其他7名博士生和7名碩士生均參與了該工作，李一博教授為文章通訊作者。水稻團隊練興明教授和中科院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心韓斌院士團隊為本研究提供了野生稻、農家種和栽培稻的材料和數據。該研究得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、華中農業(yè)大學自主創(chuàng)新基金的資助。
【Abstract】
Cloning quantitative trait locus （QTL） is time consuming and laborious, which hinders the understanding of natural variation and genetic diversity. Here, we introduce RapMap, a method for rapid multi-QTL mapping by employing F2 gradient populations （F2GPs） constructed by minor-phenotypic-difference accessions. The co-segregation standard of the single-locus genetic models ensures simultaneous integration of a three-in-one framework in RapMap i.e. detecting a real QTL, confirming its effect, and obtaining its near-isogenic line-like line （NIL-LL）。 We demonstrate the feasibility of RapMap by cloning eight rice grain-size genes using 15 F2GPs in three years. These genes explain a total of 75% of grain shape variation. Allele frequency analysis of these genes using a large germplasm collection reveals directional selection of the slender and long grains in indicarice domestication. In addition, major grain-size genes have been strongly selected during rice domestication. We think application of RapMap in crops will accelerate gene discovery and genomic breeding.
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-25961-1
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