江南大學(xué)陳堅院士團(tuán)隊劉龍教授課題組在Nature Communications發(fā)表從頭合成甜茶苷與萊鮑迪苷酵母底盤細(xì)胞的構(gòu)建與優(yōu)化的研究成果

　　近日，Nature Communications在線發(fā)表了江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心和生物工程學(xué)院陳堅院士團(tuán)隊劉龍教授課題組的研究成果“De novo biosynthesis of rubusoside and rebaudiosides in engineered yeasts”（Xu et al., Nature Communications. 2022. 13:3040） （https://www.nature.com/articles/s41467-022-30826-2）。劉龍教授為論文的通訊作者，我院2018級博士生徐雅夢為論文第一作者。

 

　　隨著高糖、高熱量飲食引發(fā)的糖尿病、高血壓、肥胖等一系列健康問題被廣泛關(guān)注，具有高甜度、低熱值等特點的甜味劑的開發(fā)已成為近年來的研究熱點。其中，植物來源的天然低熱甜味劑（如甜茶苷、萊鮑迪苷等）因具有安全、穩(wěn)定等優(yōu)點備受消費者的青睞，目前已被廣泛應(yīng)用于食品和飲品等行業(yè)。

 

　　甜菊糖苷是從甜葉菊中提取的一類天然甜味劑，根據(jù)其側(cè)鏈上葡萄糖基位置和個數(shù)的不同，可分為甜茶苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C等60余種類型。目前市場上的甜菊糖苷主要來源于植物提取。但植物中甜菊糖苷的豐度低，植物生長具有季節(jié)依賴性，且提取過程復(fù)雜，這限制了甜菊糖苷的大規(guī)模生產(chǎn)。與傳統(tǒng)的植物提取法相比，微生物發(fā)酵法能夠克服以上缺點，有效地提高甜菊糖苷的合成效率。因此，通過構(gòu)建微生物底盤細(xì)胞，以廉價碳源為底物從頭合成甜菊糖苷具有重要意義。

 

　　為此，本研究在釀酒酵母中重構(gòu)甜茶苷代謝合成途徑。首先，基于合成生物學(xué)中的代謝網(wǎng)絡(luò)模塊化方法將甜茶苷合成途徑分為5個模塊，包括萜類合成模塊、P450s模塊、甜茶苷合成模塊、UDP-葡萄糖合成模塊和甜茶苷轉(zhuǎn)運模塊。通過優(yōu)化萜類合成模塊，并引入P450s模塊和甜茶苷合成模塊，成功獲得甜茶苷產(chǎn)量為4.5 mg/L的生產(chǎn)底盤（圖1）。其次，通過改造P450酶、構(gòu)建人工底物代謝通道、擴大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等策略解除P450s模塊中的限速步驟，甜茶苷產(chǎn)量提高至67.7 mg/L（圖2）。隨后，結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測、分子對接等技術(shù)開發(fā)了一種針對甜茶苷轉(zhuǎn)運模塊外排泵篩選的快捷方法。通過外排泵抑制實驗判定甜茶苷外排泵屬于ABC外排泵家族；經(jīng)實驗驗證PDR11為釀酒酵母中甜茶苷的外排泵；強化甜茶苷轉(zhuǎn)運模塊后，產(chǎn)量提高至155.6 mg/L；同時，本研究通過強化MSN4表達(dá)提高工程菌株對甜茶苷的適應(yīng)性后，甜茶苷的產(chǎn)量達(dá)到205.5 mg/L（圖3）。最后，針對甜茶苷合成途徑構(gòu)建了基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型，并應(yīng)用OptKnock算法預(yù)測甜茶苷生產(chǎn)底盤中的基因敲除靶點，發(fā)現(xiàn)UDP-葡萄糖供給不足是限制甜茶苷高效合成的一個關(guān)鍵因素，通過UDP-葡萄糖合成模塊進(jìn)行優(yōu)化與代謝流再分配后，甜茶苷在搖瓶中的產(chǎn)量達(dá)到302.1 mg/L，經(jīng)15-L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)后，甜茶苷產(chǎn)量達(dá)到1368.6 mg/L（圖4）。

 

　　為了進(jìn)一步驗證上述底盤細(xì)胞的普適性，本研究基于甜茶苷生產(chǎn)底盤，引入萊鮑迪苷合成途徑，成功實現(xiàn)萊鮑迪苷的從頭合成。隨后，基于Rosette軟件對關(guān)鍵限速酶EUGT11進(jìn)行半理性設(shè)計，并通過表達(dá)元件改造與動態(tài)調(diào)控進(jìn)行代謝流的優(yōu)化，萊鮑迪苷（RA、RD、RM）在15-L發(fā)酵罐中產(chǎn)量達(dá)到132.7 mg/L（圖5）?？傊狙芯客ㄟ^系統(tǒng)代謝工程策略構(gòu)建了一株高產(chǎn)甜茶苷和萊鮑迪苷的生產(chǎn)底盤細(xì)胞，所采用的研究策略對于其他天然產(chǎn)物合成底盤細(xì)胞的構(gòu)建具有借鑒意義。上述研究得到了國家重點研發(fā)項目（2020YFA0908300）、國家自然科學(xué)基金（32021005、31930085、31870069）等項目的資助。