中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所作物分子育種技術和應用創(chuàng)新團隊與石家莊博瑞迪生物技術有限公司領銜的聯(lián)合研究小組，致力于液相生物芯片的研發(fā)。經(jīng)過幾年的努力，開發(fā)出高密度靶向測序-液相芯片技術體系，在通量、成本和效益上可以完全取代固相芯片，研究成果先后在《中國農(nóng)業(yè)科學》、《分子育種（Molecular Breeding）》和《植物通訊（Plant Communications）》雜志發(fā)表。
據(jù)介紹，與工業(yè)上的集成電路（芯片）相類似，生物芯片就是通過縮微技術，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將不連續(xù)的分析過程集成于硅或玻璃等固相芯片表面，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物成分的準確、快速、大信息量的檢測。在生物分子檢測和基因型鑒定領域，包含高密度分子標記或探針的生物芯片發(fā)揮著巨大作用，已廣泛應用于醫(yī)學、基因組學、遺傳學和育種。過去20年來，高密度生物芯片主要由兩家跨國公司主導，中國市場的生物芯片均依賴這兩家公司進行設計、制作和檢測，一方面導致中國動植物育種所需芯片的定制需求響應周期慢、發(fā)貨時間長、持續(xù)的技術支持和服務缺乏、成本高昂；另一方面，生物芯片作為生物育種關鍵性的分子檢測技術，從源頭上決定了種業(yè)的科技水平和國家的糧食安全。因此亟待發(fā)展能夠替代固相芯片、更加簡單高效的高密度分子檢測方法和技術。
聯(lián)合研究小組首先從前期研發(fā)的玉米55K SNP芯片挑選多態(tài)性高、缺失率低、染色體上分布均勻的20K SNP標記，結(jié)合靶向測序基因型檢測（Genotyping by Targeted Sequencing, GBTS）技術，對標記探針進行液相捕獲，完成了1K、5K、10K、20K等一系列液相芯片標記的開發(fā)。利用96份來自世界各地的玉米自交系和387份育種項目產(chǎn)生的中間材料對液相芯片進行測試，證實了芯片檢測的高度重復性和可靠性（Molecular Breeding 39:37, 2019）。隨后，經(jīng)過技術優(yōu)化和改進，使單個液相芯片的檢測效率在玉米中增加到40K mSNP、260K SNP、912K 單倍型。根據(jù)應用場景對標記密度的需求，通過控制測序深度就可以從同一標記集獲得從1K 到40K mSNP任意位點（擴增子）以及由此衍生的不同數(shù)量的SNP標記和單倍型（Plant Communications 2: 100230, 2021）。
圖1 靶向測序-液相芯片技術流程及其改進和優(yōu)化
靶向測序-液相芯片技術由兩個獨特但又相互交叉的技術體系組成：GenoPlexs和GenoBaits，都是在液相條件下對靶向片段進行擴增、捕獲和檢測。GenoPlexs涉及兩輪靶向位點的定點擴增，目前，該技術已可以實現(xiàn)單管高達2000對以上特定引物的混合擴增。GenoBaits的工作原理是基于目標探針與靶向序列互補結(jié)合進行定點捕獲，對捕獲的靶點序列進行洗脫、靶點擴增、建庫和測序，最終獲得目標SNP的基因型，在經(jīng)濟有效的條件下，所能檢測的靶向位點及其標記數(shù)目在玉米中可以達到40K mSNP、260K SNP 和912K單倍型的水平，在檢測密度和通量上等同于高密度固相芯片。
與常規(guī)測序檢測和固相芯片分析相比，靶向測序-液相芯片技術具有平臺廣適性，不需要借助于特定的昂貴設備，可以采用各種可供利用的測序平臺。標記定制時沒有起始樣本量和標記數(shù)量的限制，測序與標記基因型檢測可在同一管內(nèi)完成；使用時沒有單次檢測樣本量限制；可隨時向體系中加入新的引物或?qū)σ延幸镞M行調(diào)整；根據(jù)同一套高密度標記，可以通過調(diào)整測序深度來獲得不同數(shù)量的標記。所有檢測試劑均實現(xiàn)了本地化，從而大大降低了試劑成本，同時利用現(xiàn)有的測序設備降低了檢測設備的維護、管理和運營有關的成本。液相芯片技術具有高度重復性和可靠性，便于將不同時間、地點和實驗所獲得的信息進行累加、比較和綜合。與固相芯片、全基因組重測序和隨機的簡化基因組測序等技術相比，對于平臺和支撐系統(tǒng)的要求很低，不需要借助于額外的檢測技術或高度專業(yè)化的生物信息團隊（中國農(nóng)業(yè)科學 53:2983-3004, 2020）。
聯(lián)合研究小組還探討了如何在液相芯片技術的支撐下，通過分子植物育種，助推作為國家種業(yè)戰(zhàn)略的海南省南繁種業(yè)的轉(zhuǎn)型升級（中國農(nóng)業(yè)科學 54, 2021）。液相芯片技術與現(xiàn)代育種技術相融合，將助推南繁種業(yè)從單一的繁殖加代向資源引進和評價、育種選擇、純度檢測、種質(zhì)交流和產(chǎn)權(quán)保護等在內(nèi)的全產(chǎn)業(yè)鏈模式轉(zhuǎn)變，實現(xiàn)從海南冬繁到周年育種的轉(zhuǎn)變，將海南的南繁地理和生態(tài)優(yōu)勢轉(zhuǎn)化為南繁與育種相整合的全產(chǎn)業(yè)鏈優(yōu)勢，加快育種進展、提高育種效率，促進種業(yè)發(fā)展。要實現(xiàn)“海南育種，全國測試”，需要構(gòu)建包括液相芯片技術支撐下的高效育種設施、快速育種、轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術、雙單倍體育種技術、全基因組選擇等在內(nèi)的綜合育種體系。
靶向測序-液相芯片技術可取代現(xiàn)有的固相芯片技術和其他中高密度的分子檢測系統(tǒng)，廣泛應用于生物進化、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位克隆、標記性狀關聯(lián)分析、后裔鑒定、基因漸滲、基因累加、品種權(quán)保護、產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測、轉(zhuǎn)基因成分/基因編輯/伴生生物檢測等領域。聯(lián)合研究小組以玉米為例，采用867份來自世界各地不同類型的玉米自交系，分別利用不同標記類型進行多樣性、群體結(jié)構(gòu)、連鎖非平衡衰減和全基因組關聯(lián)分析。研究證實，利用mSNP及其單倍型替代固相芯片中的單一SNP標記能夠獲得額外的檢測效率（Plant Communications 2: 100230, 2021）?；诎邢驕y序和mSNP的液相芯片技術具有廣泛的物種適應性，可以用于所有動植物和微生物的分子檢測。目前已經(jīng)在13種主要農(nóng)作物、蔬菜以及部分動物和微生物中開發(fā)了基于GBTS的液相芯片50余套，并已在上述領域得到廣泛應用。
圖2 高分辨率多聚SNP （mSNP） 液相芯片檢測技術體系及其應用
參與該聯(lián)合研究的團隊還包括佛山科學技術學院、上海市農(nóng)業(yè)科學院、新疆農(nóng)墾科學院、河北省農(nóng)林科學院、江漢大學和國際玉米小麥改良中心。
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